マルチプレックス検出技術に基づくサイトカイン網羅解析技術の新進展を発表
Cloud-Clone Corp.
Cloud-Clone Corp.(本社：米国ヒューストン、中国武漢にISO認証生産拠点)は、一滴の微量サンプルから複数のサイトカインを同時に定量解析可能な「マルチプレックス検出技術」について、その最新の性能検証結果を発表いたします。
本技術は、Luminex xMAPプラットフォームおよび流式細胞計CBAプラットフォームの両主流システムにおいて、回収率80～120％、線形R2 0.97以上を達成。従来のELISA法と高い相関を示しつつ、より高感度な検出を実現することを確認しました。
これにより、マウス血清や組織洗浄液などの貴重な微量サンプルからの網羅的なサイトカインネットワーク解析が可能となります。本技術は、創薬研究、精密医療、免疫プロファイリング分野におけるハイスループット解析を支援する基盤技術として提供されます。
■研究背景
近年、生命科学研究は単一バイオマーカーの解析から、複数の生体分子を同時に捉えるシステム生物学へと大きく転換しています。特に、サイトカイン、成長因子、免疫調節因子が織りなす複雑なネットワークは、2型糖尿病、肝臓がん、乾癬などの多因子性疾患の病態解明における鍵として注目を集めています。
しかしながら、従来のELISA法は信頼性が高いものの、1回の測定で1つのターゲットしか検出できず、多因子解析においては時間・サンプル・コストの面で大きな非効率性が課題となっていました。このような背景から、複数のバイオマーカーを同時に検出する「マルチプレックス検出技術」への期待が急速に高まっています。
■研究結果について
当社は、マルチプレックス検出技術の性能を検証するため、主要な2つの商用プラットフォーム(Luminex xMAPシステムおよび流式細胞計CBAシステム)において、複数サイトカインの同時検出試験を実施しました。
【主要2プラットフォームにおける高い互換性】
xMAPおよびCBAの両プラットフォームにおいて、AREG、GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-1β、IL-22、IL-5、IL-6、TNF-αの計12項目について検証を実施し、以下の結果を得ました。
画像1:
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表1 xMAPおよびCBAマルチプレックス検出プラットフォームにおけるマルチプレックス検出試薬の比較
注：回収率80～120％を合格、R2 ≧ 0.97を良好と評価。
【ELISA法との比較における高感度検出】
外部研究において、良性気道狭窄の線維化プロセスにおける検体をマルチプレックス検出技術で解析したところ、31種類のサイトカインを同時検出するとともに、従来のELISA法と高い相関性を確認しました。さらに、マルチプレックス検出はその高感度により、IL-1βの極低濃度領域(0.37～7.62 pg/mL)における精密な変動を捉えることに成功しました。これはシングルプレックス検出では安定して実現することが困難とされています。
【微量サンプルでの網羅的解析が可能に】
マウス血清や組織洗浄液などの貴重な微量サンプルから、複数のキーファクターの定量データを一度に取得することが可能です。これにより、疾患の発症・進行の全体像を、より網羅的かつ体系的な視点で捉えることができるようになります。
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図1 マルチプレックス検出の標準曲線例(27サイトカインアッセイ)
■マルチプレックス検出技術について
マルチプレックス検出技術は、液相中に懸濁した特殊な蛍光コード化マイクロスフェア(ビーズ)をキャリアとして、フローサイトメトリーの原理を応用し、複数の生体分子を同時に検出・定量するアレイ解析技術です。本技術の実現には、「マルチプレックス試薬」が中核的な役割を果たします。
反応体系の主な構成要素は、コード化マイクロスフェア、捕捉抗体、検出対象物質、検出抗体、PE-ストレプトアビジンからなります。マイクロスフェア内部には異なる濃度の蛍光物質(APCおよびAPC-Cy7)が標識されており、励起光により異なるシグナルを発することで、複数の反応を同時に識別します(分類コード化)。マイクロスフェア表面には捕捉抗体が共有結合により固定され、検出対象物質と特異的に結合します。さらに、ビオチン標識された検出抗体が結合後、PE標識ストレプトアビジンによりシグナル増幅を行い、高感度な検出を可能にしています。
標準的な検出フローは、まずコード化マイクロスフェアと捕捉抗体を結合させた後(この工程は通常メーカーが事前に実施)、サンプル、検出抗体などを順次添加します。各マイクロスフェア上の捕捉抗体がサンプル中の複数の標的分子と特異的に結合し、さらにそれぞれの検出抗体が結合することで、同一の懸濁液中で複数の標的分子を同時に解析することが可能となります。この技術の最大の強みは、従来の検出法では困難であったハイスループット解析を実現する点にあります。
現在、マルチプレックス検出を支える主な商用プラットフォームとして、以下の2つが挙げられます。
●Luminex xMAPプラットフォーム(高通量検出の「ゴールドスタンダード」)
2種類の蛍光色素をそれぞれ10段階の強度で組み合わせることにより、理論上最大100項目の同時検出が可能です。専用機器(Luminex 200など)はデュアルレーザーシステムを採用し、マイクロスフェアの識別(検出項目の判定)とレポーター蛍光強度の読み取り(定量解析)を同時に行います。大規模研究プロジェクトや中核研究所での活用に適しています。
●流式細胞計CBAプラットフォーム(柔軟でアクセスしやすい「普及の先駆け」)
一般的なフローサイトメーター(NovoCyte D2060R、BD(TM) FACSArrayなど)を備えた実験室であれば、専用の高価な装置を導入することなくマルチプレックス検出を実行できます。導入障壁が低く、学術研究から臨床研究まで幅広い分野で採用が進んでいます。
■会社概要
商号 ： Cloud-Clone Corp.
市場 ： 非上場(米国ヒューストンに本社、中国武漢にISO認証生産拠点)
代表者 ： 李華淵(Li Huayuan)(法定代表者)
所在地 ： 本社：米国ヒューストン
生産拠点 ： 中国武漢経済技術開発区輸出加工区内
設立 ： 2009年6月16日
事業内容 ： 生命科学研究ツールの自主研究開発・製造。
タンパク質、抗体、ELISAキット、初代細胞、
マルチプレックスサイトカイン検出キットの研究開発・提供、
ならびにCROサービス。
資本金 ： 登録資本金 3,900万元人民元(約7億6,050万円相当)
URL ：
https://www.cloud-clone.com/
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